MLE12细胞

　　（1）英文名称：MLE12

　　（2）中文名称：小鼠肺上皮细胞

　　（3）规格：T25方瓶或1ml冻存管

　　（4）细胞数量：1×10^6

　　（5）组织来源：小鼠肺

　　（6）生长方式：贴壁生长

　　（7）细胞形态：上皮型

　　（8）培养液：DMEM/F12+10%FBS+1%P/S

　　（9）培养条件：37℃，5%CO2

　　（10）运输方式：常温运输（T25方瓶）或干冰运输（冻存管）

　　小鼠肺上皮细胞株培养操作

　　1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

　　2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

　　1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

　　3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

　　4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

　　、应用：

　　用于蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香烟诱导肺纤维化中的调节作用研究

　　探讨抑制和基因敲除Shp2减轻吸烟诱导小鼠肺纤维化的作用及机制。

　　方法：1、整体实验：观察Shp2特异性抑制剂PHPS1干预和肺上皮细胞Shp2基因敲除小鼠对吸烟引起的肺纤维化指标的影响。小鼠每天吸烟10支,连续10天,诱导肺纤维化模型,检测指标包括转录生长因子β1（Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1）、基质金属蛋白酶-9（Matrixmetalloproleinase-9,MMP-9）、钙结合蛋白（Calciumbindingprotein,S100A4）,胶原纤维沉积以及Shp2表达。

　　1)收集肺泡灌洗液（BALF）,采用酶联免疫吸附（Elisa）法检测BALF上清中MMP-9和TGF-β1蛋白表达；

　　2)收集肺组织,制备匀浆上清液,采用定量多聚合酶链反应（Q-PCR）法测定匀浆上清液中MMPs和TGF-β1基因的表达；

　　3)制作肺组织切片,采用免疫组化染色法检测小气道周围Shp2、MMP-9和S100A4表达；

　　4)肺组织切片,采用Masson胶原纤维染色法检测小气道周围胶原纤维沉积。

　　2、离体实验：观察Shp2特异性抑制剂PHPS1处理肺上皮细胞和Shp2基因沉默肺上皮细胞对CSE诱导的MMP-9和TGF-β1表达的影响,以及对信号分子的影响。香烟烟雾提取物（CSE）刺激小鼠正常肺上皮细胞MLE-12：

　　1)采用MTT法测定MLE-12细胞活性；

　　2)Westernblot（WB）法检测CSE诱导p-Shp2和Shp2表达；

　　3)CSE刺激MLE-12细胞,Q-PCR法检测MMPs基因表达,WB法检测MMP-9蛋白表达；

　　4)Shp2特异性抑制剂PHPS1干预细胞后进行CSE刺激,采用Q-PCR和WB法检测Shp2对CSE诱导MMP-9基因和蛋白的影响。#细胞#

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