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稳定细胞株的构建一般包含这些步骤:
1、表达质粒构建
2、细胞转染
3、pool细胞筛选
4、单克隆筛选
5、细胞库建立
1、表达质粒构建:
将带有内切酶位点的抗体轻重链碱基序列通过聚合酶链反应(PCR)方法合成,然后与载体连接构建表达质粒,抗体的轻重链可放在不同载体上。为保证克隆到载体中的靶基因的准确性,在转染宿主细胞前需对表达质粒中的靶基因进行测序。
2、细胞转染:
将表达质粒通过四种不同的方法(化学法、物理法、脂质体转染、病毒转染)导入哺乳动物细胞内,最为常用的是电穿孔转染法、脂质体转染法和聚乙烯亚胺介导的转染方法。转染的成功率取决于细胞的活性、质粒DNA的纯度、转染试剂及转染方法。
3、Pool细胞筛选:
细胞池筛选与评估:转染后的细胞需要在选择性培养基中培养至活率完全恢复,用以产生稳定的细胞池。选择试剂的使用取决于表达载体携带的选择基因及宿主细胞的类型。过于CHO K1细胞,通常不含谷氨酰胺的培养基中添加MSX进行筛选;而DG44和DXB11细胞通过不含呈甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶,并对细胞池增加MTX的选择压力来提高抗体表达水平。在细胞池筛选阶段,需要对细胞池表达抗体的产量和关键质量进行评估,根据评估结果选择3-4个细胞池进行克隆。
4、单克隆筛选:
单克隆筛选与评估:传统的单克隆筛选方法多采用有限稀释法,形成率呈泊松分布。为保证单克隆的单一性,需要一轮以上的克隆筛选,通常低于1个细胞/孔的方法进行铺板,挑选300个克隆经过24孔板、6孔板、T方瓶的摇瓶逐级扩增,最后挑选出10-20个克隆进行摇瓶规模评估,根据细胞生长和产物质量特性,挑选出4-6克隆进一步在反应器中评估,并建立RCB。
5、三级细胞库的建立:
细胞库的建立为满足大规模抗体生产的需要。根据生物反应器评估结果及细胞株稳定性研究数据,选择生产用工程细胞株及备选细胞株,并建立原始细胞库PCB,然后GMP条件下建立主细胞库和工作细胞库。
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