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目前,细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻,细胞内外的水分会很快形成冰晶,从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高,pH值改变,部分蛋白质由于上述原因而变性,引起细胞内部空间结构紊乱,溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶,使细胞内结构成分造成破坏,线粒体肿胀,功能丢失,并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变,使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多,随冷冻温度的降低,冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤,而致细胞死亡。
因此,细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。通常采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂(渗透型),这两种物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性,且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外,减少胞内形成冰结晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤。对于一些原代细胞(皮肤细胞),除渗透型保护剂外,还会适当添加表面型保护剂(海藻糖),以提高细胞存活率。
所需材料
1.超低温冰箱或液氮罐
2.0.25%胰蛋白酶
3.20%以上血清的完全培养液或血清
4.DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121℃蒸气高压消毒)
5.2 ml专用细胞冻存管
6.吸管、离心管、喷灯、冻存管架
贴壁细胞的冻存
1.选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用0.25%胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入等量完全培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。然后将细胞收集于离心管中离心(200 g,5分钟)。
2.去上清液,加入含20%以上小牛血清的完全培养基或血清,于4℃预冷15分钟后,加入10%的DMSO,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,分装于细胞冻存管,细胞浓度为3×106~1×107/ml之间。
3.将上述细胞分装于冻存管中,将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻存日期,同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。
4.先将冻存管置入置于4℃30 min,再转入-20℃2 h后,再放入-80℃冰箱冷冻过夜,次日保存到液氮罐中。
目前更多使用程序降温盒,将细胞冻存管放于盒内,直接置于超低温冰箱,程序降温盒可控制每分钟下降1℃。目前也有商业化的快速冻存液,可不经过程序降温过程,直接置于超低温冰箱。
注:细胞冻存后可以长期保存,但为妥善起见,冻存半年后,最好取出一支冻存管的细胞复苏培养,观察生长情况,然后再继续冻存。
悬浮细胞的冻存
1.直接将细胞收集到离心管
2.200 g离心5 min,弃上清
3.以生长培养基(含20%胎牛血清)或100%胎牛血清重悬细胞至终浓度约107/ml,加入10%的DMSO。
4.以每管1 ml分装至冻存管中。
5.置于4oC 30 min,再转入-20℃2 h后,再放入-80℃冰箱冷冻过夜,次日保存到液氮罐中;或置于程序降温盒中,按相关的操作指南进行操作。
液氮罐使用注意事项
1.初次使用前检查容器内胆是否清洁干燥,外部有无凹陷及严重碰伤,如有轻微凹陷及碰伤,经试验其蒸发性能不变,仍可继续使用,如性能下降,应停止使用,避免经济损失。
2.液氮容器应放在阴凉干燥处,应有良好的通风,不应放置在靠近热源,阳光直照,以及风口处,严禁放置液氮容器的房间紧闭门窗,以免室内因液氮蒸发使氧气含量下降,造成呼吸困难。
3.只能用于充装液氮,冻存细胞和病毒用,严禁充装液氧等易燃易爆及腐蚀性液体,以免产生猛烈燃烧、爆炸或对容器产生腐蚀。
液氮是超低温液体(-196℃),在充装时,要穿长袖工作服、带皮手套,以避免液氮飞溅造成冻伤。
贮存容器不得作贮运容器使用。若运输液氮。必须使用B型贮运容器。因此类容器有特殊支撑结构,坚固可靠不易损坏。
4.液氮容器在使用过程中,每天都应随时检查容器的使用情况,如发现容器瓶盖上和上部有水珠或结霜情况,说明容器质量出现问题,应立即停止使用。
5.存入取出样品要标记,拿取东西要轻拿轻放。