---

　　当我们需要运输或者长期不用某种细胞时，通常会使用冻存的方法来保存。若未做好细胞冻存，还会直接影响后续细胞复苏状态，所以细胞冻存的重要性不容小觑。

　　本期细胞学堂将带来贴壁细胞和悬浮细胞的冻存操作步骤及注意事项，以便大家查漏补缺。

　　在进行冻存操作前，可预先配置好冻存液；若使用无血清非程序冻存液，则无需自己配制，也无需使用程序降温盒。

　　01、贴壁细胞冻存操作

　　◆将待操作的细胞去上清，用PBS润洗；

　　◆去上清，加入胰酶消化，消化完成后加入完全培养基终止消化，并吹打均匀制备成细胞悬液；

　　◆1200rpm（250g）3min离心后尽量吸干净上清，收集细胞沉淀；

　　◆加入配置好的冻存液重悬，一个T25培养瓶长到80%左右密度的细胞量可冻存1支，或者细胞计数后，按照3~5×106cells/支冻存，冻存液用量推荐0.5~1mL/支；

　　◆分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；

　　◆将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；

　　◆最后将冻存管转移至液氮长期保存。

　　02、悬浮细胞冻存操作

　　◈直接将细胞悬液于1200rpm（约250g）3分钟离心后尽量吸干净上清，收集细胞沉淀；

　　◈去上清，用配置好的冻存液重悬细胞，一个T25培养瓶长到传代密度时的细胞量可冻存1支，或者细胞计数后，按照3~5×106cells/支冻存，冻存液用量推荐0.5~1mL/支；

　　◈分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；

　　◈将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；

　　◈再转移至液氮长期保存。

　　注意事项

　　01、细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中；

　　02、应选择汇合度80%-90%左右，处于对数生长期时的细胞进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整；

　　03、程序冻存盒、细胞冻存液、完全培养基等试剂都要复温至室温备用；

　　04、冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤；

　　05、冻存细胞长期保存应放置于液氮，不建议在-80℃长期保存；

　　06、若没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜→液氮保存，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化。

---