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　　污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃。决定要进行细胞培养，首先-定要有强烈的无菌意识，操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好。

　　一般情况下，如果你的细胞被细菌污染了，培养皿或瓶中的细胞状态很快就会发生变化，表现为胞浆中出现大量的颗粒，液体浑浊、培养基PH下降，变成黄色，贴壁细胞形态变圆、会脱壁死亡；而受到真菌污染的细胞，细胞状态并不会马上发生变化，培养3-4天后，可能才会在培养皿中看到白色的漂浮物或者黑色的小点儿。

　　常见细胞培养污染判别

　　真菌污染

　　真菌种类多，形态各异，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。

　　细菌污染

　　污染后大多能改变培养液pH培养液变混浊，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

　　支原体污染

　　支原体(Mycoplasma)是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.3-0.8微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。

　　细胞培养的支原体污染来源主要有

　　(1)细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；

　　(2)细胞培养操作人员的口腔、皮肤等；

　　(3)细胞培养用的组分，如血清、培养液等；

　　黑胶虫污染

　　黑胶虫可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。

　　常见细胞培养污染判别及应对措施

　　细胞培养中的常见污染主要包括：细菌、霉菌、支原体、黑胶虫、病毒和交叉污染等，每一种污染都有各自的特点。如细菌和霉菌增殖迅速，短时间就对细胞造成明显伤害；而支原体和病毒对细胞的影响则是一种缓慢长期的过程。下面就具体看看每一种污染。

　　1.细菌污染(较容易被发现)

　　引起原因：操作不规范或无菌措施不到位等；

　　细菌污染种类：白色葡萄球菌，大肠杆菌，假单孢菌、枯草杆菌等；

　　细胞污染后的变化

　　①污染后由于有大量酸性物质产生，因此培养基会短时间内由红色变为黄色；

　　②由于细菌大量增殖，培养基变浑浊，稍微振荡后可见培养基表面有漂浮物；

　　③普通倒置显微镜高倍镜观察，胞浆内可见大量颗粒(如下图红色箭头)；

　　④细胞生长缓慢，逐渐变圆脱落。

　　如下图所示：左：悬浮细胞污染后，可见悬浮细胞个体远大于杆状细菌，而细菌呈黑色颗粒状并会有较快的运动速度；右：贴壁细胞，可看到球状细菌分布于细胞周围并做剧烈运动。

　　细菌污染的细胞图片

　　细菌污染的细胞(左悬浮细胞，右贴壁细胞)

　　处理措施

　　在培养液中添加双抗(P/S)处理；可用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法，用药24~48h后再换常规培养液；

　　另外添加西司他丁钠和亚胺培南(泰能)处理细胞，适用于培养用具被打翻、使用了污染的培养液或要培养污染的组织或者冻存细胞的污染情况[1]。

　　裸鼠体内接种法是比较有效和彻底的除菌方法。主要包括腹水接种和皮下荷瘤分离细胞。既能彻底清除污染细菌，又能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。对于一些特别珍贵的肿瘤细胞，可采用裸鼠体内接种法。

　　2.霉菌污染(较容易被发现)

　　引起原因：操作不规范或无菌措施不到位等；

　　污染种类：白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，曲霉菌，孢子菌等；

　　细胞污染后的变化

　　①一般来说，培养液不会变浑浊；

　　②比较容易发现，肉眼可见点状菌落(淡黄色或者白色)漂浮在培养基表面；

　　③普通倒置显微镜下观察，可见絮状交错的菌丝或菌团生长在细胞之间；有时真菌并不是直接分布于细胞贴壁层，需要通过调整显微镜仔细观察寻找菌丝或菌团(如下图右)。

　　霉菌污染后的悬浮细胞

　　处理措施

　　添加制霉菌素和两性霉素B，但是对细胞的毒性也较大；

　　环境彻底消毒：先后用酒精、新洁尔擦洗培养箱；水盘加上饱和量的硫酸铜。

　　若细胞不是特别珍贵，建议丢弃。

　　3.支原体污染(难被发现)

　　支原体是一种自然界中能独立生活的最小微生物，能通过细菌滤器，在细胞培养过程中，支原体感染发生率很高[3]。由于支原体可以与细胞共存，生长速率受影响较小，而被忽视。支原体污染在细胞培养污染中最为隐蔽和最难察觉，但是支原体能明显影响宿主细胞代谢、RNA合成及基因表达的作用，因此越来越受到重视。

　　引起原因：主要来源于是已感染支原体细胞之间的交叉污染，支原体感染的血清和胰酶等；

　　细胞污染后的变化

　　①培养液不变浑浊，但会很快变成黄色；

　　②多数细胞在形态方面少有明显变化；

　　③在倒置显微镜下可见胞浆出现小颗粒或空泡；

　　处理措施

　　定期用支原体试剂盒检测；

　　换液可以减缓污染情况，但无法根除；

　　支原体清除试剂盒可以达到较好效果；

　　小鼠腹腔巨噬细胞清除法。

　　4.黑胶虫污染

　　引起原因：往往来源于血清；

　　细胞污染后的变化

　　①低倍镜下观察时可见黑色小点，高倍镜下可见到其做布朗运动，像小虫游来游去；

　　②细胞培养液仍然清亮，污染较轻时对细胞无影响；若太多就会对细胞造成影响。

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