---

　　1.细胞培养最初认识

　　什么是细胞培养？细胞培养是指将细胞从动物或植物体内取出，然后在适宜的人工环境中生长的过程。细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离，也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。

　　原代培养

　　原代培养是指细胞从组织中分离出来后，在适宜条件下增殖，直到它们占据所有可用的基质（即达到汇合状态）的培养阶段。在此阶段，必须通过将细胞转移到含有新鲜生长培养基的新容器中进行继代培养（即传代），以为其提供更多的继续生长空间。

　　细胞系

　　第一次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。来自于原代培养的细胞系寿命有限（即：有限细胞系），随着细胞的传代，生长能力最强的细胞会占据优势，最终导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度的均一性。

　　细胞株

　　如果通过克隆或其他方法从培养物中阳性筛选出了细胞系的亚群，则该细胞系成为一个细胞株。与亲代细胞系起始时相比，细胞株通常会获得一些其他的遗传学改变。

　　有限细胞系与连续细胞系

　　正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖能力，这是一种由遗传决定的事件，称之为衰老；此类细胞系被称为有限细胞系。

　　但是，一些细胞系可以通过被称为转化的过程而变为永生化细胞系，该过程可以自发发生，也可以通过化学或病毒诱导而发生。当一个有限的细胞系经历转化并获得无限分裂的能力时，它就成为了一个连续细胞系。

　　培养条件

　　各种细胞的培养条件相差很大，但是培养细胞的人工环境必须包括合适的容器，其中含有一定的基质或培养基，为细胞提供必需的营养物质（氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质）、生长因子、激素和气体（O2、CO2），并调节生理化学环境（pH、渗透压、温度）。大多数细胞为贴壁依赖性细胞，必须附着于固体或半固体基质上培养（贴壁培养或单层培养），而另一些细胞则可在培养基中漂浮生长（悬浮培养）。

　　冷冻保存

　　如果传代时有多余的细胞，则可使用适当的保护剂（例如DMSO或甘油）处理细胞，并在-130°C以下的温度下保存（冷冻保存），直至使用。记住，并不是非要-180℃。

　　细胞培养的应用

　　细胞培养是细胞和分子生物学所使用的一项重要技术，为细胞正常生理和生化研究（如代谢研究、衰老研究）、药物和毒性化合物对细胞的作用、以及致突变性和致癌性研究提供了上佳的模型系统。

　　细胞培养还可用于药物筛选和开发，以及生物化合物（如疫苗、治疗性蛋白质）的大规模生产。在这些应用中，使用细胞培养的一大优势在于，使用来源于同一克隆的一批细胞可获得稳定一致、可重复的结果。这也许是细胞培养的最主要应用场景。

　　2.原代培养及其操作步骤

　　原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。

　　原代细胞也并不是非要分离，如果经费允许可以豪购。

　　操作步骤如下

　　1、剪切组织：先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。

　　2、消化分离：消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。

　　3、培养：细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。

　　4、注意事项：

　　（1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。

　　（2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。

　　（3）胎牛血清：胎牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的胎牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号胎牛血清后，就保持应用至实验完成。想了解血清的秘密，可以参考Nothing：关于血清，你不知道的太多了

　　（4）胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20℃低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。

　　（5）L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱贮存两周以上时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。

　　（6）静置培养：原代细胞在消化分离后，置于CO2培养箱的头24～48h(必要时72h)内，应处于绝对静置状态，切忌不时地取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增殖，初学者尤应注意。不必担心培养液中的营养成分会消耗光，在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。

　　（7）消化时间：一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已经松散，略经吹打即成细胞团或单个细胞，过久的消化往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低。

　　（8）其他生长因子：经过以上处理，一般原代分离细胞培养均可以成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子，如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。另外，内毒素、EGF、FGF等均有促有丝分裂作用，但费用较高。

　　3.传代培养及其操作步骤

　　原代细胞培养成功以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞允许培养的细胞扩增(形成细胞株)，可以进行细胞克隆，易于保存，但可能丧失一些特殊的细胞和分化特征。传代细胞形成细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。

　　细胞株也是可以购买的。

　　1、操作步骤：

　　（1）吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。

　　（2）向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。

　　（3）置37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，2~5min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。

　　（4）吸出消化液，向瓶内加入Hanks液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。

　　（5）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。

　　（6）用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。

　　（7）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。

　　2、注意事项：

　　（1）掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。

　　（2）掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时间应缩短，过低时细胞消化时间相对延长。

　　4.体内细胞培养及操作步骤

　　1、瘤细胞悬液接种

　　（1）无菌选取生长良好(有光泽，淡红色)瘤组织或对数生长期培养瘤细胞。

　　（2）在PBS中将瘤组织剪碎后用匀浆器研磨，经80～100目筛网过滤成细胞悬液。

　　（3）培养细胞应用PBS洗两遍。

　　（4）计数并调整细胞浓度至10^7～10^8／ml。

　　（5）常规消毒后，于接种部位(通常为背部或腋窝腹股沟皮下)用医用注射器皮下潜行一段后注入细胞悬液(0.1ml／部位，＞10^6细胞)。初次接种成功率低，细胞数尽可能多一些。

　　（6）次日注意观察动物一般情况。初次接种一般有一段较长的潜伏期，以后随着传代潜伏期逐渐缩短，最后固定为一个相对稳定的时间。

　　2、腹水瘤的建立与腹水瘤的接种将实体瘤细胞直接种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤细胞，将这种腹水反复传代，即可成为腹水瘤。初次传代时，腹水常呈血性(含大量红细胞)，反复传代后腹水逐渐变成乳白色。腹水瘤的接种过程如下。

　　（1）将冻存或培养的腹水瘤细胞离心和洗涤，进行细胞计数。

　　（2）消毒动物，左下腹穿刺接种10^6腹水瘤细胞。

　　（3）接种腹水瘤细胞后约7~12d，待小鼠腹部明显膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9号针头抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。

　　（4）抽取的腹水经3000rpm离心15min，收集上清，分装冻存备用。

　　5.培养细胞的冻存及复苏

　　原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。

　　1、冻存细胞：

　　（1）选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前1d换液。

　　（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5×10^7／ml左右密度，离心，去上清。

　　（3）加入配制好的冻存液（培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜(DMSO)或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。

　　（4）分装于无菌冻存管中，每管加1.5m悬液。

　　（5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记。

　　（6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。

　　操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。

　　2、复苏细胞：

　　（1）从罐中取出冻存管。

　　（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。

　　（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。

　　（4）低速离心(500～1000r／min)5min，去上清后再用培养液洗一次。

　　（5）用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。

　　冻存细胞数量要充分，密度应达到107／ml，在融后稀释20倍时，仍能保持5×105／ml数量。

　　细胞的冻存和复苏，让某些细胞可以保存到现在。

---